精子浓度检测的技术方法

精子浓度是指每毫升精液中精子的数量，以10“/表示，传统的检测方法有血细胞计数板计数法、Maeri计数板计数法，近年来又采用计算机辅助分析法等

(一)血细胞计数板计数法

国际上认为血细胞计数板计数法是精子计数的“金标准”， WHO编写的《人类精液及精子一宫颈黏液相互作用实验室检验手册》第四版仍推荐使用此方法

1.血细胞计数板的结构

细胞计数板房板由一块厚玻璃底板与一块专用盖破片组成，底板中央有两个计数池，深度为01m0，每个池为3x3mm，每池平分为9个大方格，中间一个大方格用双线画分为25个中方格，每个中方格又用单线分为16个小格，美玻片为血细胞计数板专用，厚度为0.4~0.7mm。

2.常用精液稀释液

(1)NaHCO35g、36%甲醛1m、龙胆紫饱和水溶液0.5mL(在相差显微镜下观察可加龙胆紫料)，加水至100mL。(2)40%甲醛1mL、TritonX-100 1m加入0.1 mol磷酸盐缓冲液至100mL(pH值7.4)

(3)尿素40g，蒸馏水100mL。

3.操作方法

数误差。(1)取已液化精液10mL，加精液稀释液90u，充分摇匀后注入计数池中，一般5uL左右，刚好充满整个计数池，如果加量过多，常可引起盖玻片与计数板之间间隙增加而导致计(2)加样本后静置6分钟左右，待精子完全沉淀在底部后，再在镜下观察，计算中间方格的4个角和中央方格内的精子数目。

4.计算

5个中方格的总数乘以106，目即为每毫升报告数。

5.注意事项及计数原则

(1)由于计数池深达0.1mm，精子可能重叠在不同的焦点平面上，计数时须不断调节焦距以免计数遗漏。

(2)为使计数准确，不同浓度的精液应作不同倍数的稀释。一般精子浓度小于20x10/mL时稀释度为1:5或1:10;精子浓度在20x106~100x106/m时，按1:20稀释;精子浓度大于100x106/mL时，应稀释50倍或50倍以上。计数时以精子头部为标准，精子头部有1/2跨在线上时为有效计数。在同一标本中应计两个计数池，以两个池的计数平均值作为报告值。若两个池值相差大于10%，应重新加样计

(二)Makler精子计数法

1.Makler精子计数板结构

hnda精子计数板也是由庆盘和盖板两部分组成，底盘是一块金属圆板，中央为光学玻璃载物平台，载物平台四周有四根石英圆性支撑，支柱高出平台0mn，石英有很强的耐磨性，盖板是四同镇嵌金属的玻璃，具有很好的平整度，其中刻有100个0.01mm’的小格，盖上盖板后遗留孔隙深度为10mm，恰好能容纳一个精子在水平方向上自由运动。

2.Macro板结构

Mhada情子计数板是以色列产品，价格易贵，南京军区总医院和南京金陵医院共同研究制成国产的Ma0板，可以代替进口的hde精子计数板，其原理与Nke精子计数板基本相同。baco板也是由底板和盖报组成，底板为一块长形玻片，与显微境载物合相匹配，移动灵活，底板有三个地光宝石圆性，使盖板与底板之间的间源保持10pmn，而日使盖板与支撑壮接触紧密。盖板厚度有imn与a.4m两种，前者适用于20x~25x物镜，后者适用于普通显岗镜4x物镜。计数网格一般刻在底板中央，为100个0.01mm2的小格，也有将网格刻在盖板上的。

3.计数方法

(1)取液化精液10uL，加90w精子稀释液，充分摇匀(或在旋涡振荡器上震荡)吸取10u稀释精液滴干Makler计数板或Macro计数板上,加上善板置于显微镜平台上

(2)于镜下计数100小格内的精子数，计数原则与血细胞计数板相同。

以100个小格的计数总数乘以106即为每毫升的精子浓度。

(三)Microce I计数法

AD1S等病的蔓延，给从事精液分析的检验者和科研人员带来潜在的危险。另外，hada精子计数板操作时如不严格，任何细做的误差都可能影响最终结果，而且dia精子计数板经多次反复擦洗后，也可能会影响其测量精度，19年，Ginsbury和Amand发明了一次性的Microce Ⅱ精子计数板，专用于精子计数。

1.Microce n计数板的结构

Micoe山计数板是在一块载破片上用环氧树脂粘上一层一定厚度的疏水件材料，其上善上盖玻片，盖玻片与载破片之间形成固定的间除，其深度有三种，即120m、20m及s0m，常用的为20m，每块Mic0ceЩ计数板有2个计数池可以分析2份标本。

2.操作方法

果。

取已液化的精液标本3~5，从盖玻片的边缘(有箭头标记)处注入计教池，疏水件材料通过手细管作用，将精液东满载破片与盖破片之间的间吃，并将空气接出、检查时用网格目镜计数，计数结果按网格信数梅算出106MT的络

Woeu计数板主要用王精液自动分析议，由于其深度周定，避免了因模作带来的不必要的课差，计数结果比加细胞计数和0de有更高的精确性，目前被认为是景生的精液分析工具、因总是一次件使用。或本较高、国内已开始研究一次性使用的精子计数板，亦可供精子自动分析仪使用。

(四)精子浓度粗估法

此法用于估计绩子浓度或用于决定稀经精液的倍数,用微量移液管吸取已流化的清液!0mL，用吸水红吸去管外端尖黏附的绩液、洛精液滴于洁净破片上，盖上2x?2mm的盖破片，使绩液自然散开捕港差破片下、此耐精液厚度丝20m，置于40倍显微镜下观察，选择情子分布较询匀的部过，计算若于视野，求出每个视野的平均数，乘以00即约为每毫升的精子浓度值，如果请子数目少于每个视野!~2条，则可报告精子浓度小于2x106mL，同时注明能否看型子活动。如果未见有精子，则应将精液离心，确定沉渣中也无精子，才能报告为无精子。

(五)计算机辅助的精液分析(Computer Aided Semen Anahysis，CASA)

传统的精液检査分析常受主观意识的影响，不同的检验人员在同一标本中所得的结果可能相差甚远。同一检验人员在同一标本中重复检查的结果也可能并不相同

在分析精子运动能力方面也显示了其独特的优越性。到目前为止已发展到第三代。CASA是20世纪80年代发展起来的新技术，除了可以计算精子浓度、活动力等各项指标第一代用相差显微镜，精子成为一个光点，利用光点灰度的移动曲线数据，用电脑软件计算出精子的密度和运动的各项指标。但是它不能完全区分精子和非精子碎片的光点，而且不司厂家出品的型号与软件缺乏统一的国际标准第二代为荧光染色精子质量图像分析仪。这是将精液进行荧光染色，精子被染色，且农度和运动的各项数据，可较准确地将精子活力分为精子被染成绿色荧光，死精子被染成红色荧光，通过荧光显微镜和电脑技术读取和计算精子的五级--A、B、C、D(不运动的活精子)和E(死亡精子)。同时还可以利用荧光免疫技检测病、梅毒、支原体和衣原体等性传播疾病的病原体。

形态精子及各种畸形精子的百分比。鉴别的标准化，减少了人为操作的误差，这给男性不育的乡治提供了更可靠信息，精液分析自动化是今后发展第三代CASA技术可将精液染色涂片置入系统内，自动鉴别分类出各级生精细胞、正常的趋势。据悉，第三代CASA系统在国内已研究成功。世界卫生组织尚没有推荐在精液常规析中应用CASA技术。

1.CASA的基本原理和组成结构

ceI计数板等)、高分辨率的摄像装置、计算机和显像装置等构成。在相差显微镜下，每个精CASA由相差显微镜、恒温装置、专用计数板(如Makler计数板、Marcro计数板或Micr子形成一个光点，精子运动的态势就可以呈现在显像屏幕上。在计数时，可以将一个视野的光点移动态势转换成数码储存入计算机中，通过计呆存，以备日后研究与分析。机软件分别综合分析出结果，并由打印机打印出报告单。这些数码也可转刻到储存器如光盘中

2.CASA检查结果及含义简介

除了传统精液常规分析的精子浓度、活动率和运动力外，还有:

(1)精子运动路径速度(VAP)。指精子在一定范围内运动的平均速度。一般分为四织

a级(快速运动)指VAP>25mm/s;

b级(中速运动)指VAP在10~25um/s;

c级(慢速运动)指VAP<10mm/s;

d级(静止不动)指VAP=0um/s。

(2)轨迹运动平均速度。

①曲线平均运动速度(VCL)指精子非直线运动的平均速度，正常值大于40mm/s。

②)直线平均运动速度(VSL)指精子前向直线运动的平均速度，正常值大于20um/s。

③运动与尾部摆动关系。

a.精子摆动幅度(ALH)是指精子运动轨迹平均侧摆的幅度。有的软件使用最大值，因此不同型号之间的结果，不能相互比较,。

b.鞭打频率(BCF)是指精子摆动轨迹的平均频率。

c.平均移动角度(MAO)是指精子运动轨迹瞬间转折角度的时间平均值

④分析指标。

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a.线形度(LIN)也称直线性，即精子运动轨迹的直线分离度。LIN-VSL/VCL.

b.前向性(STR)是评价精子运动平均路径的直线分离度。STR-VSL/AP。

c.摆动性(WOB)表示精子实际运动轨迹摆动空间尺度。WOB-VAP/VCL。

d.前向运动精子浓度:精子浓度乘以a级精子百分率。

由于更用区种设备份查，视野以较小，精子计算多限别在20~30个之间，但因精子的分在并不一分均匀、考在洗图如野拾育时，光洗泽影活的部分进行格查，或因为出现清子深集而在除一些切野、可能会对结里浩成很大的影。因此，在精子过密时，应适当进行稀释，使每次检查能多几个视野，结果可能会更加准确。

3.操作方法

目前，国内已有多家工厂生产这种设备，不同厂家生产的型号不同，操作也并不完全相同，需根据其说明进行具体操作。4.正常参考值

精子浓度>20x106/m;精子活动率的正常参考值>65%;精子活动力的正常参考值为a级精子>25%或a级+b级>50%.。

5.临床意义由于精子在男性生殖道中处于休眼状态，它被排出并与附属性腺分泌物接触后才开始复苏活动，因此，精子的运动情况不但是精子本身结构是否正常的反映，而且是生殖道各附属性腺分泌功能的集中表现。精子活动率是指能活动情子的百分率。而精子活动力分级是以精子运动的性状和运动速度为依据。影精子运动的因素有很多，除了精子本身的结构，如尾器的发育是否完善、膜的结构是否完整、头形是否符合流体力学的要求之外。还有清浆载体的酤度咀力、供应能量的果糖的数量及各种还原酶和水解酶的数量与活性、精浆p、渗透压、操作时的温度、射精后的检查时间以及操作人员的主观判别能力等，因此，这个指标的可比性是受到许多因表影坤的。尤其是在运动中的瞬间就要判别每一个精子运动的级别，是一件很难的事，即使现在用电脑自动计数仪检査，同一份标本在不同视野的结果都会出现很大的差别。

因此，单一的精子活动指标是不能作为生育能力的判断指标的，医学统计结果也提头精子，这些精子没有具备攻击卵泡并使之受孕的能力。精子运动指标与受孕率无相关性。有的精子运动非常好，但常是一些小头精子或无顶体的乡用精液特性分析仪SQA(Sperm Quality Analyzer，以色列产品)检测精子运动的综合指数液化后每分钟检测一次，经统计，正常精子运动力随着时因此，这些指标只是提示目前精子的活动状态，或是帮助判断治疗效果。笔者所在单位续一小时左右，之后又逐渐下降。因此，检测精子运动力应规定在排出后半小时，这样也有利于比较。有些学者如我国的吴阶平教授于20世纪70年代间推移而有所变化。在2分钟后就有部分精子活动，最高活动力值出现在30分钟左右，持就可能具备受孕的能力。曾提出，用粗估法检测，在一次排精中，快速直线运动的精子总数在1 500万~2000万内

精液中的细胞除了精子外，还有许多种类丰富的圆形细胞(RC)，也被称为非精子NSC一般包括四大类:未成熟生精细胞、支持细胞、免疫田胞(Nonsperm Cell，NSC)。一些研究报告指出，在正常精液中NSC占细胞总数的1.88%细胞(包括多形核白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞)和泌尿生殖道附属性腺的说落上皮细胞。在这些NSC中，一般未成熟生精细胞占83.4%，支持细胞占1.2%，免疫细胞占9.1%，免疫细胞中的多形核白细胞占5.4%、巨噬细胞占

2.6%、淋巴细胞占1.1%。

当生殖道感染时，精液中NSC明显增加;细菌类感染主要表现为多形核白细胞增加;而支原体属、衣原体和病毒类感染，则见生精细胞和淋巴细胞增加。据一些研究表明，在些不明原因的不育患者的精液中，NSC为正常生育力男性精液的3.7倍。其中未成熟的生精细胞增加2.38倍、多形核白细胞增加4.6倍、巨细胞增加5.2倍、淋巴细胞增加11.3倍，并且主要为CD 淋巴细胞。可见，精液中NSC的异常包括类量和类型的异常，都可能具有重要的病理意义，应予以足够的重视。

在精液常规检查时可以检查有无滴虫，在精液中的滴虫运动较缓慢，在前列腺液的余片中滴虫的活动比在精液中活泼得多，而在阴道涂片中的滴虫运动非常活跃，这可能与检查液(载体)的黏度及pH值有关。精液的黏稠度大而阴道检查滴虫的载体是生理盐水，又因为滴虫的鞭毛柔软缺乏刚性，所以不同载体中运动的这度有所不同。

精液常规镜检时，注意观察，有时也可看到霉菌的发亮孢子或菌丝，在染色片中，色念珠菌和其他霉菌常可被发现。服药后也可在精液中看到一些结晶体。

精子浓度大于20x10“/mL都属于正常，而且医学统计结果表明，大于20x106/mL的子浓度与受孕率无相关性。因此，大于20x10“/mL的精子浓度用精密计数价值不大。多精子症是指多次精液常规检查精子浓度均大于250x106/mL。多精子症原因不明，但常可引起不育，